1、 基于光流控显微技术 的 文献综述 1.引言 在生物或临床应用中，对样品的光学成像通常 在 昂贵和笨重的显微镜系统 下实现。 成像过程可以 说 是耗时 并且需要大量 劳动 力 的。 现在， 可 以 在一个微流体平台 下 实现一个 经济 的自动化的显微镜，这可以极大地简化和改进成像程序 及其生物医学中的应用 。 微流体装置的主要优点包括其结构的紧凑性和低成本。在应对一系列重要的小型化问题时，已证明其可以提供良好的解决方案，如流体输送、样品处理、化学传感和样本排序。然而，在亚微米芯片上的光学成像仍然是一个悬而未决的问题。在现有 的微流体系统中，在忽略微分析系统的体积和成本的优势的情况下，仍然选择使
2、用笨重的传统显微镜完成高分辨率成像的。作为一个参考点，根据物镜的数值孔径大小与波长使用范围来考虑，一个商业常规显微镜分辨率可以达到大约 1m 到 0.2m。 一个可能的低分辨率成像策略是将样品直接叠加在一个二维传感器阵列的顶部，并用一个均匀的光场照射样品。然而，所得到的传输图像的分辨率是由传感器的间距大小所决定的，典型的感器的间距的大小为 5 毫米或更大，用这种方法是难以实现显微镜的高分辨率。 Lange 等人 7使用这种方法展示了一个分 辨率为 10 微米结构紧凑的片上成像装置。 2.显微技术在光流控领域的研究现状 2006 年， Xin Heng, David Erickson 等人提出了
3、一种新型的以微流体为基础的无透镜的成像技术，称为光流控显微技术（ OFM），并通过光流控显微镜展示了秀丽隐杆线虫的成像，其测量的分辨率极限为 nm 40490 。 OFM 装置由具有亚微米 大小孔径组成的 蚀刻阵列的不透明金属膜和结合到金属膜 上的 PDMS 微流控芯片组成。孔径阵列和微流控芯片的制作是分两个单独的 步骤进行。制备孔径阵列时，将 90 nm 厚的铝首先在石英晶片上蒸发 ， 然后在 PMMA 光刻胶上通过光刻 获得 孔径阵列（其直径 D = 600 nm；间距为 5 m），接着通过反应离子刻蚀转移到铝层。在制备微结构 时，首先在 Microchem SU8 光刻胶 进行光刻 ，然
4、后转移到 PDMS 弹性体上。微流控芯片粘附在金属层，其准确排列由光刻机来完成。微流体通道是一个 30 m 宽， 15m 高的原型。入射光源强度为 0.1w/cm2。其结构图如下所示。 图 2.1 斜孔阵列布置是该成像方法的关键性 创新。原则上， OFM 原型可以作为孔间图案沿 Y 方向的阵列。然而，在这样的结构中， 如果 没有 将 2 个或更多孔映射到相同的传感器像素 ， 是不可能 把减小 孔 的安置距离使其小于 传感器像素的宽度。斜孔阵列布置使我们能够确保每个孔 都能映射到 不同像素的传感器阵列 上 ，以确保相邻的孔之间的间隔是 与 像素宽度 相等的 (如 图 (c),(d)。同时，行扫描
5、 的间距可以通过简单调整沿 Y 轴 方向 的孔 间距 来 任意调节。这样的安排 可以 确保相邻的线扫描重叠和目标的所有部分 都可以 成像。在这个配置中，该系统的分辨率 受到 孔的直径 的限制 ，而不是传感器的像素大小。最 后， 他们认为 OFM 原型实现测量的要求是在 经过孔 时， 目标的方向和形状保持不变。 图 2.2 为了 展示 OFM 原型的成像能力， 他 们 对在幼虫阶段的 野生型线虫（ C. elegans） 进行成像。首先样品在 70的 热 水中浸泡 3 min，然后将它们与 浓度为0.1%牛血清白蛋白（ BSA）溶液 混合 。 BSA 溶液 可以有效 降低 样品对通道壁 的粘附。
6、压力驱 使 的流量用来驱动的 样品 通过通道。浓度约为 5 C. elegans nL-1 ，平均传输速度为 300 mm s-1。由于 CCD 像素的采集时间为 2.5 ms，这个速度 能够使沿 X 方向 的 有效像素尺寸 平均 为 750 nm。最大限度的实现图像采集率为 40 worms min-1。平均而言，大约 45%的图像是由于样本 反转 （通过 对 孔径 A、 B 检测）和线虫聚集 而被排斥 。类似的光照条件下 ， 图 2(a)-(c)显示该线虫几间图像，与图 2（ d）显示一个线虫 在 倒置显微镜下获得的图像。线虫咽部在 OFM 图像 中可辨， 这可以证明 OFM 至少能达到传
7、统显微镜的 的 检测 能力 。 图 2.3 2008 年， Xiquan Cui, Lap Man Lee 等人提出了无透镜的高分辨率的片上光流控显微 镜，并对秀丽隐杆线虫和细胞进行成像。他们预计，光流控显微镜可解决一系列的生物医学和生物科学的需要，并产生新的显微镜的应用。 他们提出了几种 片上 的 成像方案 （如图 2.4），并对其进行 比较。 (A) 直接投影成像 方案：通过将试样直接放置在传感器网格的顶部，可以得到一个具有分辨率等于像素大小的投影图像。 (B)通过放置在一个网格的孔的试样，我们可以得到一个稀疏图像。 然而，对于相同的网格密度，所获得的图像 其 改善 不会超过方案 A。 (
8、C)通过光栅扫描样品的孔径的网格，可以得到一个“ 充满的 ” 图 象。在这种情况下，图像的分辨率 受 孔径 大小 所限制 。网格密度不再是解决问题的一个因素 。 (D)扫描方案可以简化成一个单一的整个网格的试样流定位网格在一个小角 ()相对于流动方向（ X 轴）。 (E)通过一个长的线性阵列孔径阵列可以被简化的孔径网格。该方案是 在 光学显微镜方法的基础上。 图 2.4 他们提出的光流控显微镜 原型 如下图所示 。 (A) 设备的示意图（ 顶 图）。该结构的 间孔（白色圆圈）在 被 二维 CMOS 图像传感器（浅灰色虚线网格） Al 层上轮廓分明 （灰色）， 且 横跨整个微流控通道（蓝线）。
9、(B) 与美国四分之一的实际设备相比。 (C) 垂直运作模式。 (D) OFM 运行的流程图。该线虫 的 两 张 OFM图像是由两 OFM 阵列获得，分别为（红色箭头）。如果图像的相关性为 50%，图像对被拒绝。否则，该区域和蠕虫的长度，通过评估的轮廓（绿色虚线）和中线（黄色虚线）自动测量。 (E) 对电驱动装置的制造间断面。 图 2.5 图 2.6 是秀丽隐杆线虫野生型 L1 幼虫的实验图像。 (A) 通过两 OFM 阵列对相同的线虫（ C. elegans）的重复 OFM 成像。 (B) 像素大小为 9.9 m 的 CMOS图像传感器的直接投影成像。 (C) 目镜放大倍数为 20 的常规显
10、微镜获得 的图像。 图 2.6 分析线虫 L1 幼虫的表型特征。 (A-C) 典型的野生型 OFM 图像，分别是 sma-3和 dpy-7 蠕虫。图 (D 和 E)，野生型的长度 (D)和有效宽度 (E)。列代表在人口中的平均值；孵化的区域对应的平均值的置信区间，和误差线是表明在人口中个人之间变化的标准偏差。每个表现型用 25 条蠕虫进行评价。如下图所示。 图 2.7 OFM 原型的分辨率 如图 2.8 所示。 (A) PSF 的测量原理。 (B)在麻雀标准下，直径0.5 m 和 1m 的孔不同高度的分辨率。 (C)(D)野生型线虫 L1 幼虫分别在 15 到 25 米高的微流体通道的 OFM
11、 图像。 (E)(F)OFM 的径向频谱图像，分别在 0.62 和 0.38 m-1 处3dB 的带宽（虚线红线）。 图 2.8 2010 年， Shuo Pang, Xiquan Cui 等人提出了 无 透镜 的 片上 彩色显微 系统， 将其称为 彩色光学显微镜 ( color OFM)， 并且展示了由 LacZ 基因表达双 倍 染 色 的秀丽隐杆线虫在光照强度 为 10 mW/cm2 下的 成像。 图 2.9 彩色 OFM 结构原理图 该 系统采用彩色 CMOS 传感器芯片 代替 单色 CMOS 传感器芯片，并采用孔径阵列排列 以便调节 Bayer 彩色像素排列。 文中还 描述 了彩色 O
12、FM 原型 的规格参数及其 工作原理；给出了 OFM 原型的标定实验，证明它能够 在 不同光照强度下确定一个染料 （ 台盼蓝 ）的浓度； 展示 经 蓝色 LacZ 的 -半乳糖苷酶 和 胭脂红（ 一种非特异性的红染色 ）表达的 微观秀丽隐杆线虫 (C. Elegans)的 成像图案 。 彩色 OFM 原型 是 在彩色 CMOS 传感器 基板上 制备的 ，其中 传感器由 2048 1536 个大小为 3.2 微米的 像素 组成 。这些像素每一个都有一个三种不 同 颜色 的彩色滤光片 覆盖 ， 该彩色滤光片能够 发射红色，绿色 或蓝色 区域的光学光谱。 彩色 像素被布置在一个由 2 个 成 对角线
13、 分布 的绿色像素， 另外 一个红色的像素和一个蓝色像素 组成的 拜耳图案中，如 下 图所示 。 图 2.10 他们 旋涂 一层厚度为 300 nm 聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA)在 传感器的表面 以起到平滑表面的作用，接下来 用一种金属蒸发器 来放置 300 nm 厚的铝层 在 有机玻璃层 表面。 （在这些层的厚度，单个像素的轮廓 在 扫描电镜成像技术 后仍清晰可辨，其 表面 平坦从而可以 让 PDMS 的 后续焊 接块 粘附到 芯片 上 ）， 在 铝层 上 用一个聚焦离子机 来研磨出 两列 140 个的小孔 。然后又 将一层厚度为 200 nm 的有机玻璃 覆盖在 在铝层上 用 来 保护孔
14、。孔径的直径为 0.7 m， 孔间距 为 9.6 m（相当于 3 个 像素宽度）。这 2 个阵列也间隔 9.6 m 分开。比较宽的间距选择，以尽量减少相邻像素的串扰效应。在铣削过程中 ， 保证孔 的 研磨严格控制 在 单像素的正上方。第一和第二阵列孔图案 的 彩色像素重复序列 分别为 RG 和 GB。最后， 用 光刻机软光刻技术将 包含一图案化的微流体通道聚二甲基硅氧烷（ PDMS）块 覆盖在传感器 上。 其宽度为 40 m,高度为 20 m。 通 道设定在 0.05 弧度的角度 以 确保相同颜色的 孔重叠，每个 重叠 的宽度为 0.7 m（见图 2.11）。该系统 用光强为 10 mW/cm
15、2 卤素灯均匀地照射 。 图 2.11 OFM 的 图像形成 机理 不同 于 常规显微镜。 OFM 采用小孔对样品的投射光进行采集， 而不是 在 一定收集角内 的 散射点收集光。因此，在不同波长 下， 光通过光圈 的 收集效率需要 对其 量化。装置的光谱响应采用不同波长的光照射装置 来 测量。 他们 记录了范围从 400 到 600 nm 的光谱响应 ，以 20 nm 量递增 增。图 2.12显示 的是 红色，绿 色 和蓝色 的光谱响应， 以及作为比较的 与未处理的 彩 色 CMOS传感器。结果表明， 孔径对 蓝色和绿色像素光谱响应 只有 轻微的影响 ，而对 红色像素 有 一些偏差。 这一 影
16、响足够 调节 和表明 ：其 制造 过程 没有 明显地 降低彩色滤光片 对 像素 的影响 。这组数据有助于帮助我们归一化 对 OFM 装置的 测量。 图 2.12 他们展示了其装置原型，并用其对经 Lac Z 表达染色的线虫成像。 Lac Z 表达的位置可以用 Lac Z 染料很容易地定位，该 LacZ 染料包含人造底物 X-gal、被b-galactosidase 裂解时会变蓝。他们还另 外用丽春红对蠕虫染色，做为获得第二个颜色（红色）的方法。其成像图案如下图所示。 图 2.13 LacZ 染色 在 红色和绿色 的 OFM 图像 中 清晰可见， 但 很难在蓝色图像 中 识别。这个观察结果 表明
17、 LacZ 染色 容易 吸收的红色和绿色 的 部分光谱 ，对 蓝色 光谱的吸收比较 弱。 彩 色的 OFM 图像可以 让我们看见 非特异性丽春红染色在 蠕虫的 中部和尾部。 并且其 原型能 够对 样品中 彩 色 染料的成 像 及对其进行 区分 有 显着的改善。 2010 年， Asger Laurberg Vig, Rodolphe Marie 等人提出了集成在一个微流体捏流分离（ PFF）分离装置上的，基于光学检测的片上光学显微镜（ OFM），其具有三维空间分辨率。 OFM 被集成到一个基 于 捏流分离（ PFF） 的 微流体大小分离装置 上 ，定位在所谓的展宽段，如图 2.14 所示。当粒
18、子在通道中 ，光 传递 通过 小孔会 受到 影响。光通过信道后 通过目镜 收集，重定向到一个 CCD 上 。收集 到 光 的 角度 由目镜的数值孔径 决定 。 图 2.14 装置的信号输出如图 2.15 所示。他们展示了具有背面照明的成品装置的显微镜图像，该 OFM 孔出现了白点；还展示了一种孔径扫描电子 显微镜图像，各向同性的铝蚀刻的足迹清晰可见。含有颗粒的样品从样品入口通道进入一个狭窄的夹紧段通道。无论 尺寸 大小，颗粒沿着壁整齐排列，通过从缓冲入口通道的流体流动。随着颗粒进入一个更宽的通道，从通道壁到颗粒中心的距离被放大，并根据大小的把颗粒分离。当分离的微球通过扩大段，它们影响通过 OF
19、M 孔透射的光传输。光通过每个孔的径向扩散，并收集在一个具有一个特征的角度锥。 图 2.15 图 2.16 是 测量装置的横截面图。该装置是安装在卡宽流体连接上。设备的背面是由平行光进行照明，这是通过在设备的发射部分 由一个 10X 物镜收集空气 （ NA = 0.3） ，通过透镜聚焦到 CCD。 图 2.16 通过实验，从 OFM 的传输读出如下图所示。 (A) 2.1m 的聚苯乙烯球通过孔时的时间函数。 (B) 2.1m 微球的传输对几个孔 中光传输的 影响。 (C) 30 个2.1m微球通过上述孔的参考荧光显微镜图像。显微镜的曝光时间比较长，所以微球作为线出现在图像中，且在图像 可以看出
20、 几个微球已通过。 图 2.17 微流体装置中透射光的传播的横截面 如下图所示 。双球在 2 个不同的水平位置通过 。 I：球体正好位于孔的上方，所以传输的倾角最大。 II：球体与物镜的光的锥切向锥切，而从这个孔径的透射是不受影响的。球体影响 从 五个孔 出来的光传 输。 图 2.18 在 Z 方向的检测精度，取决于微球半径的标准偏差和残留层厚度的不确定性。在这项研究中，采用半孔间距的确定。该微球半径的标准偏差为 5%，其规模和残留层的不确定性是 0.1m。 传播的不确定性，在 Z 方向的检测精度等于1.4m。在该系统中的流速对测量成功是至关重要的。在高速下，只有由微球体的中央部分排列的孔产生
21、的传输浸高于检测极限。在这种情 况下，信息的位置丢失。因此，在低速度下操作系统是必须的。在 Z 轴仍然可以检测最大的速度和所用 CCD 的最小曝光时间有关。粒子最大飞行速度为 2 mm/s，对应的流速为 22 L/h。 他们提出的光学显微镜 (OFM)装置可以用在以下几个方面： 1).平面内检测直径大小 在 1m-4m 的 分离微球，其精度为小于 0.92m。 2).平面外检测精度为 1.4m。 3). 粒子图像测速技术（ PIV）其精度 为 0.08 mm/s。在所有测量结果与荧光显微镜 测得的相 对应，符合理论预期结果。 3.参考文献 1 Heng, X.; Erickson, D.; B
22、augh, L. R.; Yaqoob, Z.; Sternberg, P. W.; Psaltis, D.; Yang, C. H., Optofluidic microscopy - a method for implementing a high resolution optical microscope on a chip. Lab on a Chip 2006, 6 (10), 1274-1276. 2 Cui, X. Q.; Lee, L. M.; Heng, X.; Zhong, W. W.; Sternberg, P. W.; Psaltis, D.; Yang, C. H.,
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24、oscope with 3D spatial resolution,3 Pang, S.; Cui, X. Q.; DeModena, J.; Wang, Y. M.; Sternberg, P.; Yang, C. H.,Implementation of a color-capable optofluidic microscope on a RGB CMOS color sensor chip substrate. Lab on a Chip 2010, 10 (4), 411-414. 4 Vig, A. L.; Marie, R.; Jensen, E.; Kristensen, A., Optofluidic microscope with 3D spatial resolution. Optics Express 2010, 18 (5), 4158-4169.
