1、硫 酸 软 骨 素一、产品简介:硫酸软骨素是来自动物软骨组织的一类天然的酸性粘多糖（因其具有粘稠性）糖胺聚糖（其中糖胺聚糖作为动物蛋白聚糖的代表成分，在软骨组织中以蛋白多糖形式存在） ，不同动物体内所存在的硫酸软骨素类型不同，主要是 CAS、CSC 及各种硫酸软骨素的混合物，其中猪牛羊的骨中主要含有硫酸软骨素 A，鲨鱼乌贼等海洋动物的软骨中主要含有硫酸软骨素 C。区别：蛋白多糖以蛋白为核心，糖蛋白以多糖为主体；或者说侧重点不同，虽然组成成分是一样的，但是糖蛋白定义为蛋白，蛋白聚糖定义为糖。糖胺聚糖： 1）蛋白聚糖由三部分组成-核心蛋白、糖胺聚糖、连接区寡糖； 2）糖胺聚糖除了通过共价键与蛋白聚
2、糖的核心蛋白连接( 糖肽键）外，糖胺聚糖还通过静电作用或立体化学效应与其他蛋白质发生专一性程度不同的结合。而蛋白多糖的聚集体则通过次级键（氢键和盐键）形成，可见从软骨组织中提取硫酸软骨素仅依靠破坏次级键的方法是不够的，而必须以降解蛋白质的方法，破坏多糖链与蛋白的共价结合方能达到提取硫酸软骨素的目的； 3）因为糖胺聚糖具有粘稠性，所以蛋白聚糖也被称为粘蛋白。软骨中粘蛋白等中的糖胺聚糖多由两种氨基己糖（氨基葡萄糖和氨基半乳糖）之一和两种己糖醛酸（葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸）之一以各种糖苷键连接而成； 4）除透明质酸（属于非蛋白多糖提取）外，糖胺聚糖分子中的氨基己糖上均含有硫酸基，该硫酸基与己糖醛酸上的
3、羧酸都会导致整个蛋白聚糖分子显酸性，所以糖胺聚糖又被称为酸性粘多糖。2、理化性质:1、物理性质：硫酸软骨素，简称 CS，分子式：（C 14H21NO14S)n，成品外观白色粉末状，无臭无味，易溶于水，不溶于乙醇和丙酮、冰醋酸等有机溶剂，遇水后迅速膨胀，对热不稳定，需避光密封保存。其分子中含有大量的硫酸基和羧基，故呈酸性反应，可与钠钾钙离子结合成盐，其盐类对热稳定。在高温、碱性、酸性环境溶液中易水解成单糖或小分子量多糖，因而溶液粘度下降。 （游离的硫酸软骨素水溶液遇较高温不稳定，主要是乙酰基被水解，从其结构上脱落下来。 ）2、化学性质：硫酸软骨素是来自动物软骨组织的一类天然的酸性粘多糖糖胺聚糖。
4、硫酸软骨素是氨基己糖和葡萄糖醛酸交替连接而成的直链分子，作为动物糖胺聚糖中的代表物质，硫酸软骨素由 D-葡萄糖醛酸和 N-乙酰-D-氨基半乳糖（结构图如下所示）以 1,3 糖苷键连接形成双糖，双糖单位之间以 1,4 糖苷键连接。一般硫酸软骨素约含有 50-70 个双糖单位，动物组织中的硫酸软骨素平均分子量约为260000。在分子结构上硫酸软骨素氨基己糖环的 4 位或 6 位可硫酸化。图 1 图 2图 5图 7注：乙酰不是一种物质，它是一种基团，或者说是官能团，是乙酸去掉羟基后剩下的部分，写为 -COCH3。硫酸软骨素常见化学反应有降解反应，硫酸软骨素不仅在高温强酸条件下易发生降解反应，使其分子
5、量降低，同时在硫酸软骨素裂解酶等的作用下也可发生降解。其中硫酸软骨素可被浓硫酸降解成小分子组分，并被硫酸化，降解的程度和硫酸化的程度随着温度的升高而增加，在 30-50温度下，2h 可使平均分子量降至 3000-4000；也可在稀盐酸溶液中水解而成为小分子产物，温度越高水解速率越快。硫酸软骨素是一种聚阴离子的高分子化合物，多数含有-SO 3H和-COOH 等基团，易与 Na、K、Ca2、Mg2 等阳离子结合，故其都是以金属盐成分制成药品。根据糖胺聚糖双糖中单糖分子类型、羧基和硫酸基位置的不同，可将其分为透明质酸、硫酸软骨素 A、硫酸软骨素 C 等几类。其中透明质酸又称玻璃酸，组成单糖为 D-葡
6、萄糖醛酸和 N-乙酰氨基葡萄糖；硫酸软骨素 A 组成单糖为 D-葡萄糖醛酸和 N-乙酰-D-半乳糖-4-硫酸；硫酸软骨素 C 组成单糖为 D-葡萄糖醛酸和 N-乙酰-D-半乳糖-6-硫酸；由此可见透明质酸为糖胺聚糖中唯一的非硫酸化多糖，其他糖胺聚糖的硫酸化位置和数量与其生理功能密切相关。3、分离提纯原理及方法简介:1、制备原理硫酸软骨素属于酸性粘多糖，目前酸性粘多糖的提取方法主要有降解法和非降解法。非降解法仅用于非蛋白多糖的粘多糖-透明质酸。降解法适用于包括透明质酸在内的所有酸性粘多糖，其主要包括碱盐法、碱提取法、酶提取法、超声波法等。1）碱提取法：是基于硫酸软骨素与蛋白质结合的 O-糖苷键可
7、在碱作用下发生消去反应，使糖肽键断裂，硫酸软骨素从蛋白多糖中释放出来，但在强碱作用下硫酸软骨素也易发生降解。2）盐法提取：基于一定离子强度下软骨中的某些蛋白质会产生沉淀，从而实现硫酸软骨素与蛋白质分离的目的。3）碱盐法：利用碱性条件下，连接硫酸软骨素和蛋白质的糖肽键发生断裂，使硫酸软骨素以游离态释放，并且通过控制一定的离子强度，使软骨中的某些蛋白质沉淀析出，便于滤除。一定范围内，提取物中硫酸软骨素的含量和得率是随着碱液浓度的增加而提高。4）超声辅助法：是利用超声波的空化作用，使物料周围形成空穴，从而有利于硫酸软骨素提取的方法。原理是在碱性条件下蛋白质易离解和超声波的热学机制可促进蛋白质快速解离
8、而达到去杂蛋白质的目的，升温（85-90）均可使解离的蛋白质变性吸附到白陶土上，从而使硫酸软骨素与蛋白质分离，提高产品质量。采用超声辅助的碱提酶解法提取硫酸软骨素，其提取物中硫酸软骨素的含量和得率并无明显提高，但可大大缩短提取时间。5）酶法：软骨中的胶原蛋白和粘蛋白等在中性或弱酸性条件下是可溶的，不易被分离除去。酶法是利用不同蛋白酶水解蛋白质的特异性，使蛋白质水解成氨基酸，再利用硫酸软骨素与氨基酸的溶解性不同将其提取出来的方法。酶法条件温和，不易引起硫酸软骨素的降解，常用的酶制剂有胰酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和链霉菌蛋白酶等。提取物含氮量越低，表明提取物中的杂质蛋白含量越少。2、纯化方
9、法溶剂法：是利用软骨中不同化学成分的溶解性差异，而将硫酸软骨素与其它杂质相互分离的纯化方法。硫酸软骨素含有的硫酸基、羧基和羟基等亲水性基团，使其易溶于水，不溶于乙醇、甲醇、丙醇和丙酮等有机溶剂。超滤膜法：是利用滤膜孔径的不同使硫酸软骨素与其它非多糖类杂质分离，而得到分子量范围较窄且纯度较高的硫酸软骨素的方法。季铵盐沉淀法：硫酸软骨素在溶液中以聚阴离子形式存在，与季铵盐类化合物形成水溶性很小的季铵盐络合物，这些络合物在低离子强度的水溶液中不溶解，但当其增大到临界离子强度时，可发生解离并溶解，利用该性质可使硫酸软骨素得到分离纯化。离子交换色谱法：是依靠库仑力的作用将物质吸附在交换剂上，然后选用合适
10、的洗脱剂进行洗脱，达到其纯化的目的。常用于硫酸软骨素纯化阴离子交换剂有树脂、纤维素和葡聚糖凝胶等。电泳法：根据化合物所带电荷类型和数量的不同，采用电泳法可将硫酸软骨素和其他杂质分离开。电泳法具有分辨率、目标纯度和回收率较高的特点。四、酶法制作工艺实验流程：1、具体提取方法：从鲟鱼头中取出软骨，洗净，切成小块，置于大烧杯中 100水浴加热 12h，中途换水两次以除去表层油脂，冷却后漂洗，沥干水后送入 60干燥箱干燥约 5h，干燥完全后粉碎得到软骨粉。称取一定量软骨粉，根据一定的固液比加蒸馏水溶解酶，放入摇床恒温反应，反应时间中间时刻调加入胃蛋白酶直至反应完全。反应液水浴加热进行酶灭活处理，冷却后
11、调至中性，离心取清夜，并加入清液体积的两倍乙醇进行沉淀， 边加入乙醇边搅拌， 放入冰箱静置 24h，离心取沉淀，沉淀送入 50干燥箱干燥约 3h，得硫酸软骨素粗品。酶反应温度过高会引起酶失活，温度过低酶活性不高，木瓜蛋白酶最适温度 5060，胃蛋白酶不耐低温，胰蛋白酶最适温度为 45.本实验综合三种酶最适温度，设定反应温度为 38，故温度不作为单因素考虑。1）酶浓度因素：酶浓度不同，其他因素相同，随着酶浓度的提高，粗品提取率随之升高，但酶浓度升高到一定值（15mg/g),提取率不再增大。2）时间因素：反应时间不同，其他因素相同，随着反应时间的增长，粗品提取率随之升高，但反应时间超过 50h，提
12、取率虽然有所增长，但增长空间不大。另外，提取时间过长，得到的产品颜色加深，提取时间应以软骨全部溶解为准。3）固液比因素： 固液比不同，其他因素相同，随着固液比的增高，粗品提取率随之升高，但固液比升高到一定值（1:12） ，提取率不再增大。原理：硫酸软骨素分子具有很高的吸湿性，因为其中的硫酸软骨素分子是以多聚阴离子的形式存在的羧基和硫酸基可吸附带正电荷的水分子，吸附相当于自身重量的数百倍的水分。在反应体系中，大部分水分子和硫酸软骨素因静电作用结合，并非游离态，因此反应溶液的粘度大，结合酶动力学说，底物分子与酶分子的碰撞概率减小，反应速率低。故高固液比，可使溶液变稀，降低溶液的粘度，从而提高提取率
13、。2、硫酸软骨素各项指标测定方法1）葡萄糖醛酸含量测定采用咔唑比色法，绘制葡萄糖醛酸标准曲线2）样品纯度测定采用咔唑比色法，绘制硫酸软骨素标准曲线3）蛋白质的标定取不同浓度牛血清白蛋白，采用考马斯亮蓝法，测其 595nm处 吸光度，绘制标准曲线。4）脂肪含量测定依据 GB50009.6-85，索氏抽提法测定硫酸软骨素中脂肪含量。5）PH 测定5、综述1、原料中除含有蛋白多糖外，还有大量的蛋白质、无机盐、脂肪、结缔组织及残留的肌肉。为了提高硫酸软骨素的纯度，首先应尽量去除软骨上的肌肉、脂肪、结缔组织；其次，应将软骨尽量粉碎，以提高提取率和降低浸提时间；另外，硫酸软骨素的提取率和纯度高低与所采用的原料部位有关。2、酶法反应条件温和，操作简单，不会引起硫酸软骨素的降解，固液比越高，得率越高，最后达到平衡。但快速反应也可能使反应体系升温，引起蛋白质和粘多糖的分解并产生副反应，产品颜色加深，不符合质量要求，因此注意放入恒温箱反应。同时提取时间过长也会使产品颜色加深，应以软骨全部溶解为准。乙醇量选择为清夜体积的 2 倍，在进行除杂质等的处理时因浓度高造成较大的损失，溶剂量大使成本增加。3、在制备硫酸软骨素时，由于是粗提工艺，得到的是硫酸软骨素同分异构体（对映异构体属于同分异构体的一种）的混合物，如果想得到高纯度的各个组分，需要进一步分离制备，并进行分子结构的定性检验。
