1、题目：根据所学分离技术设计一分离过程，从苦 瓜籽中分理出-苦瓜素和-苦瓜素。,核糖体失活蛋白（Rip）概念：一类具有核糖核酸(RNA)N-糖苷酶活力的生物毒性蛋白,可以水解核糖体上的28s rRNA第4324位腺嘌呤N-糖苷键,使核糖体失活,从而使蛋白质合成不可逆地受到抑制,表现出抗肿瘤、抗病毒活性。,分类：型Rip：为一种单链蛋白，分子量约25 32kD。 -MMC、-MMC、-MMC、MAP30型Rip：由两条或四条多肽链组成，分子量在60kD或者120kD左右。-MMC新型Rip：-MMC，相对分子质量为24 000,苦瓜籽中的活性成分：,蛋白质、多肽、黄酮、脂肪酸、番茄红素（类胡萝卜素
2、）、苦瓜 籽油和一些挥发性成分。,一、 材料、仪器与试剂,苦瓜籽，BioCAD700E灌注色谱工作站， DEAE-650C阴离子交换柱(15cm id20cm) 及CM-650M阳离子交换柱(15cmid68cm)，高速冷冻离心机，476A蛋白质测序仪ALPHA1-2LD冷冻干燥机。所用试剂均为分析纯。,分析纯：指做分析测定用的试剂，杂质非常少，不妨碍分析测定，适用于工业分析及化学实验。 化学纯：指一般化学试验用的，有较少的杂质，也不妨碍实验要求； 色谱纯：指进行色谱分析时使用的标准试剂，在色谱条件下只出现指定化合物的峰，不出现杂质峰。 电泳纯：指生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生
3、物大分子使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后，可达到在一维电泳仅显示一条带，或二维电泳仅显示一 个点的纯度。电泳纯为检验生化物质的最高纯度。对于具体纯度，不同的药品要求不一样。,苦瓜籽粗提液的制备,离子交换色谱对苦瓜籽Rip的分离,垂直板状十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,N-端氨基酸序列测定,将200g去壳苦瓜籽磨碎,加入500mL2mmol/L磷酸缓冲液(PBS)(pH7.2),于4搅拌浸提4h后,再于4离心(10 000r/min)10min,上清液用50%(体积分数)丙酮水溶液沉淀,沉淀物在200mL2mmol/L PBS(pH7.2)中重新溶解后即为粗提液。,离子交换
4、色谱,离子交换色谱法是基于离子交换树脂上可解离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，根据这些离子对交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。亲和力高的，在柱中的保留值愈大。按结合的基团不同，离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。,蛋白质与离子交换剂结合是靠电荷间的静电吸引。吸引力的大小与溶液的PH有关。常通过改变盐类离子强度和PH值来完成蛋白质混合物的分离。结合力小的先被洗脱出来。 离子交换色谱分离蛋白质是根据在一定PH条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离方法。 常用于分离的离子交换剂：弱酸型羧甲基（CM）纤维素和弱碱型二乙基氨基乙基（DEAE）纤维素,梯度洗脱装置,梯度
5、洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的分配系数k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，从而达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。,先将苦瓜籽粗提液稀释后上样到DEAE-650C阴离子交换柱上,在2mmol/L PBS(pH7.2)缓冲体系中用01mol/L NaCl/20min进行梯度洗脱,得到一个穿透峰和两个洗脱峰。,在色谱工作站柱处接上DEAE-650C柱,柱处接上CM-650M柱。柱和柱先同时在线,由单根DEAE柱得知走完穿透峰所需的时间，当苦瓜籽粗提液在柱1中穿透完后，让柱1离线，柱2在
6、线，这样柱1的穿透峰直接进入到柱2，而此时柱1离线，吸附在柱1中的蛋白质相对于目的蛋白来说是杂蛋白被除去，柱1的穿透峰相当于柱2的上样样品，在柱2中进一步分离纯化。,对各组分做SDSPAGE电泳检测,原理：蛋白质为两性电解质，它在一定pH值溶液中的电荷性质是独特的，在电场中泳动一段时间后，便会集中到确定的位置呈一条致密区带。由于不同的蛋白质等电点和分子量是不同的，因此，经泳动后，就形成了泳动度不同的区带。利用此性质，便可把混合的蛋白质分离开，同时也可对其纯度进行测定 。,目的：鉴定核糖体失活蛋白分子量并对所鉴定物进行纯化。 十二烷基磺酸钠（ SDS ）：阴离子去污剂 ，使不溶的蛋白质样品溶解，
7、并使蛋白质带上大量的负电荷，使其相对迁移率只与蛋白质分子量有关，可以用以测定蛋白质的分子量。聚丙烯酰胺凝胶（ PAGE ）：具有分子筛的作用，能把蛋白质很好地分开。,峰8和峰9组分的SDS-PAGE图,峰8和峰9经电泳检测均达到电泳纯,相对分子质量都为30 000左右,N-端氨基酸序列测定,目的：判断峰8和峰9所对应的核糖体失活蛋白（-MMC、-MMC）。 原理：蛋白质一级结构也称化学结构，指的是蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序。由于-MMC、-MMC具有不同的排列顺序，故可用N-端氨基酸序列测定。,-核糖体失活蛋白氨基酸序列：DVSFRLSGADPRSYGMFIKD 天冬氨酸缬氨酸丝氨酸苯丙
8、氨酸精氨酸亮氨酸丝氨酸甘氨酸丙氨酸天冬氨酸脯氨酸精氨酸丝氨酸酪氨酸甘氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸异亮氨酸赖氨酸天冬氨酸-核糖体失活蛋白氨基酸序列：DVNFDLSTATAKTYTKFIED 天冬氨酸缬氨酸天冬酰胺苯丙氨酸天冬氨酸亮氨酸丝氨酸苏氨酸丙氨酸苏氨酸丙氨酸赖氨酸苏氨酸酪氨酸苏氨酸赖氨酸苯丙氨酸 异亮氨酸谷氨酸 天冬氨酸,结果： 经N-端氨基酸测序知峰8的N-端氨基酸序列为DVSFRLSGAD-PRSYGMFI,与所报道的-MMC的N-端氨基酸序列相同,峰9的N-端氨基酸序列为DVNFDL-STATAK,与所报道的-MMC的N-端氨基酸序列相同。 由相对分子质量和N-端氨基酸序列知峰8和峰9分别是-MMC和-MMC,
