1、 1/ 4 慢病毒 感染细胞 实验方 法 2/ 4 一、实验概述 培养生长状态良好的目的细胞，根据慢病毒感染预实验结果设计各组实验条件，进行正式感染。若为荧光标记的慢病毒感染，参照预实验确定的感染时间点，于荧光显微镜下观察 GFP表达情况，荧光率达 70-80左右，细胞汇合度达 80%左右，收集细胞进入下游实验。若为抗性基因（如 Puromycin）标记的慢病毒感染，感染 48 h-72h后，使用抗生素筛选 48h，收集细胞汇合度 70%-80%左右的生长状态良好的细胞进行下游实验。 二、实验材料 1. 主要试剂 试剂名称 试剂来源 cat.No. 胎牛血清 Ausbian VS500T DM
2、EM Corning 10-013-CVR 胰酶 生工生物工程（上海）股份有限公司 T0458-50G Puromycin Clontech 631305 D-Hanks 上海吉凯基因技术有限公司配制 2. 主要仪器 仪器名称 仪器来源 cat.No. 荧光显微镜 奥林帕斯 IX71 CO2 培养箱 日本三洋 SANYO MCO-175 倒置显微镜 上海蔡康光学仪器有限公司 XDS-100 离心机 赛默飞世尔科技 (中国 )有限公司 Fresco 21 生物安全柜 上海振样创空气净化设备有限公司 Bio 1200- -A2 三、实验步骤 1准备目的细胞 （ 1） 从液氮罐中取出细胞冻存管 ，
3、迅速放入 37水浴中，并丌时摇动使其尽快解冻。 （ 2） 完全解冻后， 1300 rpm，离心 3 min， 75%酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜。 （ 3） 吸去冻存液上清，加入 1 mL 新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有 3 mL 完全培养基的 6-cm dish 中，轻轻晃匀后置于 37、 5% CO2 培养箱。 （ 4） 24 h 后更换一次培养液继续培养，待细胞汇合度达 80%左右传代培养，保持细胞良好的生长状态 。 3/ 4 2 目的细胞慢病毒感染 （ 1） 贴壁细胞： a. 处于对数生长期的细胞胰酶消化，完全培养基制成 3-5104 个 /mL 细胞悬液，并根
4、据 表 1 接种相应的细胞数到培养板中，继续培养保证感染时铺板量达到15-30%左右 。 表 1. 贴壁细胞接种和病毒感染时感染液体积 底面积 接种体积 换液体积 96 孔板 0.3 cm2 100 l 100 l 48 孔板 0.6 cm2 200 l 200 l 24 孔板 2 cm2 500 l 500 l 12 孔板 4 cm2 1 ml 500 l 6 孔板 10 cm2 2 ml 1 ml T25 瓶 25 cm2 5 ml 2.5 ml b. 按照预实验结果，参考 表 1 更换感染培养基，加入最适病毒量进行感染。 c. 参照预实验结果，选择感染后最适时间点更换为常规培养基继续培养
5、，一般为感染后 8-12 h 左右。 （ 2） 悬浮细胞： a. 按照预实验确定的感染条件，使用感染液将细胞制成 3-5105 个 /mL 悬液， 并根据 表 2 接种相应的细胞数到培养板中。 表 2. 悬浮细胞接种体积 底面积 接种体积 48 孔板 0.6 cm2 200 l 24 孔板 2 cm2 500 l 12 孔板 4 cm2 1 ml b. 铺板后无需培养，参照预实验确定的 MOI 加入最适病毒量感染。 c. 参照预实验结果，选择感染后最适时间点，一般为 8-12 h 左右，将各孔中细胞收集到干净的 1.5 ml EP 管中，以 2000 rpm 离心 2 min，去掉上清液，更换
6、为完全培养基，轻轻混匀后继续培养 （备注：如 48 孔板感染可扩大至 24孔板继续培养） 。 3 观察感染后细胞状态及感染效率 （ 1） 细胞状态良好，未出现大量死亡现象，特别是保证 NC 组不 CON 组细胞状态相当。 （ 2） 一般而言， 细胞 感染效率达到 70%以上，就可以继续下游实验 。 a. 荧光标记的慢病毒感染。感染后 72 h 左右 ， 荧光显微镜观察 报告基因（如 GFP）的表达情况，荧光率即为阳性感染率； b. 抗性基因标记的慢病毒感染。一般于感染 48-72 h 后，换用含抗生素（如4/ 4 puromycin)的培养基筛选细胞，细胞存活率即为阳性感染率。 4 细胞状态良好，感染效率合格组，可用于下游检测；否则重新感染。 注： 操作时污染了病毒的管子和枪头以及培养基和最后的细胞都需要用消毒液处理后才能丢弃。
